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亲子鉴定采样要求-亲子鉴定DNA提取程序

作者:黄主任 来源:本站 发布时间:2022-07-20 15:04:34 阅读量:73

亲子鉴定采样要求

对于三联体,采集被检测男子、孩子生母与孩子的样本用于检验;对于二联体,采集被检测男子与孩子的样本用于检验;对于祖父母与孙的鉴定案例,则采集被检测祖父、祖母、孩子生母与孩子的样本用于检验。样本一般是血液(斑)或口腔拭子(唾液斑),其它人体生物学材料如带毛囊毛发、羊水、组织块、精液(斑)等亦可作为亲权鉴定的样本。样本必须分别包装,注明被采样人姓名、编号、采样人、采样日期等,置于冰箱冷藏或冻存。

采样时,需要填写采样单,写明委托方名称、采样日期、采样类型、被采样人姓名、性别、称谓、出生日期、证件号码等,并拍摄被采样人照片,由被采样人在采样单上留下右手拇指或食指指纹(婴儿可留右脚拇趾印),并签名确认(婴幼儿的姓名由其监护人代签)。

对于接受了外周血干细胞移植的当事人,应避免采集其血样作为检验材料,宜取其口腔拭子(唾液斑)或毛发进行检验。

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DNA提取程序

采用Chelex-100法(见如下步骤)或其它经过了验证的方法抽提DNA。若不经过DNA抽提而直接将检材用于PCR,方法必须经过验证。

1、从血样中提取DNA:

a) 在1.5 mL离心管中加1 mL 纯水,然后加入血样(不少于3 µL血液或9 mm血斑),小心混匀;放置30 min,间歇振荡;

b) 10,000-15,000 r/min离心2-3 min;小心移去上清液。若样品为血斑,则保留载体;

c) 沉淀中加入5% Chelex 100(100-200目)200 µL,56℃保温30 min;

d) 高速振荡5-10 s;沸水浴8 min;

e) 高速振荡5-10 s;10,000-15,000 r/min离心2-3 min,取上清液用于扩增反应;2-8℃保存或冻存剩余DNA。

2、从口腔刮拭物样本中提取DNA:

a) 用牙签刮拭口腔粘膜,将其放入1.5 mL离心管内,加入200 µL 5% Chelex(100-200目);搅动,使细胞脱落;

b) 56℃保温15-30 min;

c) 高速振荡5-10 s,沸水煮8 min;

d) 高速振荡5-10 s,10,000-15,000 r/min离心2-3 min;

e) 取上清液用于扩增反应;2-8℃保存或冻存剩余DNA。

(STR分型检测一般实验对样本的要求10万个细胞以上即可,尽管对于口腔拭子样本一根棉签上就可以附着10万个口腔黏膜细胞,但作为DNA亲子鉴定样本, 在方便采集的情况下,尽可能采集5-6根棉签。根据我国2010年4月10日国家发布的亲权鉴定技术规范SF/Z JD0105001-2010中的规定口腔拭子提取DNA……

STR分型检测一般实验对样本的要求:细胞数量≥106个,DNA含量>20ng/µl,体积大于20µl。对于毛发样本一般提供最少5根带毛囊的毛发(同时要求5岁以上的,因为5岁以下的毛囊长得不是很完全)。根据我国2010年4月10日国家发布的亲权鉴定技术规范SF/Z JD0105001-2010中的规定毛发拭子提取DNA……

3、从毛发中提取DNA:

a) 用纯水清洗毛发;剪取毛根部分,放入1.5 mL Eppendorf管中;

b) 加入200 µL 5% Chelex 100(100-200目)及2 µL 10 mg/mL PK(蛋白酶K),56℃保温6-8 hr或过夜;

c) 高速振荡5-10 s;沸水煮8 min(注意毛发应浸没于Chelex液中);

d) 高速振荡5-10 s;10,000-15,000 r/min离心2-3 min;取上清液用于扩增反应,2-8℃保存或冻存剩余DNA。

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4、从精液中提取DNA:

a) 取精液(不少于3 µL)放入1.5 mL离心管内,加入200 µL 5% Chelex 100(100-200目);

b) 加入2 µL 10 mg/mL蛋白酶K和7 µL 1 mol/L DTT,轻轻混匀;

c) 56℃保温30-60 min,高速振荡5-10 s;

d) 10,000-15,000 r/min离心10-20 s;

e) 沸水煮8 min;

f) 高速振荡5-10 s;

g) 10,000-15,000 r/min离心3 min;

h) 取上清液用于扩增反应;

i) 2-8℃保存或冻存剩余DNA, 再次使用时重复步骤f)-h)。

5、从精斑样品中提取DNA:

a) 适量精斑检材,剪碎后放到1.5 mL离心管中;

b) 加入1 mL纯水,室温保温30 min;

c) 高速振荡1 min,用牙签去除载体;

d) 10,000-15,000 r/min离心2 min;

e) 去上清仅留50 µL,用无菌吸头吹打沉淀;

f) 加入5% Chelex 100 100-200目)至200 µL,加入2 µL 10mg/mL蛋白酶K和7 µL 1 mol/L DTT,轻轻混匀;

g) 56℃保温60 min;

h) 高速振荡5-10 s,10,000-15,000 r/min离心10-20 s;

i) 沸水煮8 min;

j) 高速振荡5-10 s,10,000-15,000 r/min离心3 min;

k) 取上清液用于扩增反应;

l) 2-8℃保存或冻存剩余DNA,再次使用时重复步骤i)-k)。

6、从人体组织块中提取DNA:

a) 取适量组织块,用纯水冲洗;

b) 剪碎(或研磨成碎块),加入1 mL STE提取液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCI,1 mmol/LEDTA,pH8.0),混匀后加入20% SDS 75 µL,10 mg/mL 蛋白酶K 40 µL,于56℃酶解至清;

c) 于1.5 mL离心管中加入200 µL 10% Chelex 100(100-200目),加入上述酶解后溶液20 µL,混匀;

d) 56℃保温30 min;

e) 剧烈振荡5-10 s;

f) 沸水煮8 min;

g) 剧烈振荡5-10 s;10,000-15,000 r/min离心3 min;取上清液用于扩增反应;

h) 2-8℃保存或冻存剩余DNA,再次使用时重复步骤g)。

7、从羊水中提取DNA:

a) 取羊水约1.5 mL,10,000~15,000 r/min离心5 min,弃上清;

b) 在沉淀中加入200 µL 5% Chelex(100-200目)溶液和20 µL 10 mg/mL PK,56℃保温3 hr;

c) 高速振荡5-10 s,沸水浴8 min;

d) 高速振荡5-10 s,10,000~15,000 r/min离心5 min,取上清液用于扩增反应;

e) 2-8℃保存剩余DNA,再次使用时重复步骤d)。


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