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SNP分型方法和技术的检测方法-DNA亲子鉴定

作者:黄主任 来源:本站 发布时间:2022-07-27 16:39:51 阅读量:41

SNP,全称 Single Nucleotide Polymorphisms,是指基因组中单个核苷酸发生变异而形成的遗传标记,包括转换、颠换、缺失和插入,数量丰富,多态性丰富。理论上每个SNP位点可以有四种不同的变体,但实际上只有两种变体,即转换和颠换,比例为2: 1。SNPs在CG序列中出现的频率最高,大部分由C转换为T,因为CG中的胞嘧啶往往被甲基化,然后自发脱氨基为胸腺嘧啶。

一般来说,SNP是指突变频率大于1%的单核苷酸突变。人类基因组中每1000个碱基中约有一个SNP,人类基因组中SNP的总数约为3× 10 6。因此,SNP成为第三代遗传标记,许多表型差异和对药物或疾病的易感性可能与SNP有关。

根据其在基因中的位置,SNP可分为基因编码区、基因非编码区和基因间区(基因之间的区域)。由于基因序列的合并,编码序列中的SNP并不一定改变蛋白质的氨基酸序列。在编码区有两种类型的SNPs:同义和非同义。同义单核苷酸多态性不影响蛋白质序列,而非同义单核苷酸多态性改变蛋白质的氨基酸序列。

但是,不在蛋白质编码区的SNPs仍然可能影响基因剪接、转录本结合、信使RNA降解或非编码区的RNA序列。受这种单核苷酸多态性(SNP)影响的基因表达称为单核苷酸多态性表达(ESNP),可能发生在该基因的上游或下游。

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直接测序法

目前很多朋友在研究SNP位点时还在用直接测序法。桑格测序原理是双脱氧终止法,它会忠实地延伸模板链上的碱基序列。在毛细管电泳中,每个碱基的荧光信号会被依次采集,SNP的测序结果会出现以下几组峰。

优点:直接测序法是目前最直观,准确性相对而言最高的 SNP 分型方法,适用于发现未知 SNP 位点,检测少量样本,少量位点的碱基多态性。

缺点:通量太低,且成本较高,但是随着现在高通量的测序技术的飞速发展,目的片段甚至全基因组的高通量测序也让直接测序法重新焕发活力!

片段长度多态性

RFLP(限制性片段长度多态性)是SNP分型的早期技术。简单来说,含有SNP位点的序列中存在一个特定的限制性内切酶位点,SNP位点基因型的改变会使限制性内切酶位点失效,这样就可以根据限制性内切酶后PCR片段长度的多态性得知相应的基因型。

优点:适用于小批量样本的分型实验,只需要一台PCR仪和一台电泳仪,无需特殊仪器;

缺点:通量低,对位点要求高(需要特定的限制性位点),无法准确识别假阳性病例(限制性不完全)。

鉴于上述情况,如果没有找到合适的限制性位点,或者现有的限制性位点需要高成本的内切酶,那么可以通过在PCR引物中引入错配来获得理想的限制性位点。

其次,为了增加这种方法的检测准确性,一种方法是在PCR产物中选择一个内参限制性位点(与靶限制性位点一致以检测限制性是否完全),第二种方法是改进荧光限制性方法,即在PCR产物中加入荧光,通过测序仪采集荧光信号,报告产物的长度。该方法具有毛细管电泳更高的准确度和更高的分辨率的优点,并且可以混合装载。

飞行质谱法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种SNP分型技术。首先通过PCR扩增目标序列,然后加入SNP序列特异性延伸引物,在SNP位点上延伸一个碱基。将制备好的样品分析物和芯片基质共结晶置于质谱仪的真空管中,然后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发。基质分子吸收辐射能,产生能量积累,快速产热,使基质晶体升华,核酸分子会解吸转化为亚稳态离子。大多数产生的离子是单电荷离子。这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,然后根据它们的质荷比在非电场漂移区获得相同的动能。

MALDI产生的离子通常由飞行时间(TOF)检测器检测。离子的质量越小,它们到达的速度就越快。利用质谱对质量高度敏感的特点,很容易区分只含有一个不同碱基的两个基因序列,推断SNP分型。

优点:成本低,不需要合成特殊的荧光引物,只需要一对PCR引物和延伸引物;检测方便,灵敏度高,保证数据准确性;

缺点:对SNP位点两侧的序列要求较高,SNP位点、插入缺失等特殊序列的存在会影响准确性。另外样本质量有点高,补充数据比较麻烦。如果样品质量不是很好,建议慎重选择。最后,检测成本低是基于站点多,样本多。目前市面上的公司一般都是25-30个站点的系统,一个反应384孔板收费。

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Taqman荧光探针法

Taqman probe想必大家都很熟悉。原理如下:

该技术是ABI开发的SNP分型技术,其技术原理是:在PCR反应过程中,加入一对两端带有不同荧光标记的MGB特异性探针来识别不同的等位基因(等位基因1和等位基因2),5’端作为报告基因,3’端作为淬灭基因。在PCR过程中,两种探针可以特异性退火,并与正向引物和反向引物之间的互补序列结合。当探针以完整形式存在时,由于能量共振转移,荧光基团仅发出微弱荧光。

特异性探针与相应等位基因结合后,DNA聚合酶发挥5’至3’核酸外切酶活性,切割报道荧光基团,脱离3’末端淬灭荧光基团的淬灭作用,从而发出荧光。两种探针的5’末端用不同的荧光(FAM或维克)标记,3’末端用MGB淬灭基团缀合物标记。根据检测到的不同荧光,可以判断相应样本的SNP等位基因类型。

优点:操作简单,准确率高,解释方便,识别度高;

缺点:探针合成时间长,一般由ABI公司合成。从我自己的经验来看,国内合成的探针质量不稳定,价格高,通量小。一般适用于1-2个站点,对样本质量要求较高。除了样品不降解外,浓度要尽可能一致,这样结果才能集中。

多重 SNaPshot 检测方法

SNaPshot technology又称迷你测序技术,由美国应用生物公司(ABI)开发,主要针对中等通量(

通过ABI测序仪进行凝胶电泳后,根据峰的颜色可以知道掺入碱基的类型,从而确定样品的基因型,并针对不同的SNP位点设计不同长度的延伸引物,实现一个反应体系中多个SNP的分型。

优点:方法灵活,位点选择性不大,只要该位点一侧的序列满足设计测序引物的条件,就可以针对插入缺失、同源区等设计更好的检测方案。

缺点:价格比较高。

改进的连接酶检测法(iMLDR)

IMDR技术是基于传统连接酶反应的改进的多重SNP分型技术。与传统的连接酶反应技术相比,iMLDR技术提高了分型的准确性和成功率。该方法的特点是采用了双重连接反应,通过连接方法将基因分型荧光添加到连接产物中,可以很容易地增加这种分型方法的通量。

优点:与LDR相比,准确度有了一定程度的提高,检测通量更高。

缺点:和LDR一样,LDR有很高的选址选择性。

基因芯片法

DNA芯片技术是近年来发展起来的检测DNA序列变异的新工具。其原理是使靶DNA与固定在支持物上的密集寡核苷酸探针阵列发生等位基因特异性反应,根据反应信号的有无和强弱来确定SNP位点。

近年来,随着复杂疾病研究的深入和可用基因组数据的增加,基于各种原理的SNP芯片反应被开发出来,以适应不同目的、规模和条件的基因分型。那么市面上常见的Illumina SNP芯片基因分型平台(包括Infinium技术和GoldenGate技术)和Affymetrix基因分型平台(Affymetrix GeneTitan技术)是目前应用最广泛的基因分型平台,适用于不同标记密度的大样本快速基因分型。

这里有很多种商用芯片,就不单独介绍了。有需要的同学可以去各个公司官网查询。在这里,我将主要介绍两种芯片的制造差异:Illumina的技术是微珠技术,将DNA探针序列偶联到微珠表面,然后将各种微珠均匀地铺在光刻技术刻蚀出许多微孔的玻璃基板上,而Affymetrix的技术是通过光刻直接将探针序列种植在玻璃载体表面。具体技术细节在这里。

SNPSCAN 分型法

SNPSCAN 分型法利用连接酶连接反应的高度特异性实现SNP等位基因的鉴定。然后,在连接酶探针的末端引入不同长度的非特异性序列,通过连接酶加成反应获得与位点对应的不同长度的连接产物。用荧光标记的通用引物通过PCR扩增连接产物,通过荧光毛细管电泳电泳分离扩增产物。最后,通过GeneMapper软件分析获得每个SNP位点的基因型。

优点:通量足够大。原则上一次可以检测48n个位点。

缺点:对场地的要求比LDR高,因为这种方法只检测场地两边的几十个bp序列。如果这部分序列具有特殊的结构或高度同源性,那么这种方法基本上可以被告别。


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